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近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、合成與功能生物分子中心、IDG麥戈文腦科學(xué)研究所、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心鄒鵬課題組（博士生林暢為第一作者）在Cell子刊CellReportsMethods上發(fā)表了題為：Functional imaging-guided cell selection for evolving genetically encoded fluorescent indicators的研究論文。

該研究報(bào)道了基于熒光成像的定向進(jìn)化方法——Faculae，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效穩(wěn)定構(gòu)建突變體文庫(kù)，在顯微鏡下針對(duì)混合細(xì)胞文庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)表型細(xì)胞進(jìn)行快速光激活選擇。該方法實(shí)現(xiàn)了遺傳編碼遠(yuǎn)紅色鈣探針的多維度表型篩選與定向進(jìn)化。

熒光探針定向進(jìn)化的難點(diǎn)在于需要考慮多種熒光表型參數(shù)，包括熒光強(qiáng)度和動(dòng)態(tài)響應(yīng)幅度等，無(wú)法直接通過(guò)流式分選方法進(jìn)行篩選，而常用的多孔板陣列文庫(kù)成像篩選存在通量較低（~103）局限性，因此研究者認(rèn)為可以開(kāi)發(fā)一種基于熒光成像的混合細(xì)胞文庫(kù)鑒定、選擇方法，在保留多篩選維度的同時(shí)提高篩選通量、擴(kuò)大蛋白質(zhì)序列的搜索空間。

圖1：Faculae方法流程示意圖

在Faculae方法中，研究者使用基于重組酶的細(xì)胞“停機(jī)坪”（cell landing pad）方法實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建，通過(guò)聚焦照明實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨的胞內(nèi)光敏熒光分子激活，“點(diǎn)亮”具有優(yōu)勢(shì)表型的目標(biāo)細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)流式分選回收得到突變體基因型。該技術(shù)的特點(diǎn)在于可以利用熒光成像評(píng)估細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化信息和亞細(xì)胞定位信息，單次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞鑒定數(shù)量為104到105，而單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞激活僅需1-2秒。利用Faculae方法，研究者對(duì)遠(yuǎn)紅色鈣探針的亮度與動(dòng)態(tài)響應(yīng)兩個(gè)指標(biāo)同時(shí)開(kāi)展評(píng)估，從中選擇優(yōu)勢(shì)突變體，并通過(guò)迭代進(jìn)化成功獲得靈敏度提升的Nier1探針。

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